Optical nanoscopy to investigate the origin and evolution of oncogene-induced genomic damage

Background

L'instabilità genomica è una caratteristica del cancro. L'attivazione degli oncogeni può innescare la generazione di danni genomici, all'inizio del processo di tumorigenesi, attraverso alterazioni delle dinamiche di replicazione del DNA, trascrizione del DNA e risposta ai danni al DNA (“DNA damage response”, DDR). Tuttavia, nonostante la loro potenziale importanza nello sviluppo del cancro, i meccanismi molecolari che sono alla base dei danni genomici indotti da oncogene sono ancora poco compresi. In particolare, comprendere in che modo le alterazioni della DDR hanno un impatto sull'evoluzione del danno al DNA è importante per la progettazione di strategie terapeutiche più efficienti mirate sulla DDR.

Ipotesi

La nostra ipotesi principale è che l'attivazione dell'oncogene induca un'alterazione nell'organizzazione spazio-temporale della replicazione e/o trascrizione del DNA, favorendo il verificarsi di stress di replicazione e trascrizione in specifici siti del genoma. Questo stress, unito ad alterazioni nell'organizzazione della DDR, si traduce in un aumento del danno al DNA e nell'insorgenza dell'instabilità genomica nei tumori. La visualizzazione nelle cellule intatte fornirà informazioni cruciali sulla formazione del tumore.

Obiettivi

L'obiettivo principale del progetto è chiarire, attraverso l'imaging ottico a super risoluzione, i dettagli molecolari dell'origine e l'evoluzione dei danni genomici indotti da oncogene. I dati di imaging ottenuti in nuclei di singole cellule intatte, verranno cross-validati con analisi di mappatura a livello genomico sugli stessi modelli in vitro. Nello specifico, verrà visualizzato se le organizzazioni spazio-temporali dei siti di trascrizione e replicazione vengono modificate in seguito all'attivazione dell’oncogene e se queste alterazioni corrispondono a un aumento dei danni genomici. Inoltre, verrà visualizzato il ruolo delle alterazioni della DDR sull'evoluzione dei danni genomici indotti dall'oncogene.

Design sperimentale

I metodi di mappatura su scala genomica rappresentano un approccio potente per l'analisi dei processi genomici ma, sfortunatamente, non forniscono l’organizzazione spazio-temporale del nucleo cellulare. D'altra parte, la microscopia a fluorescenza convenzionale, anche con la sua straordinaria specificità, è limitata nella risoluzione spaziale a soli circa 200 nm. L'imaging ottico avanzato a super-risoluzione (risoluzione spaziale <50nm) verrà applicato su modelli cellulari di attivazione dell'oncogene, per visualizzare alterazioni di trascrizione, replicazione e DDR (e il conseguente danno al DNA) direttamente in nuclei di cellule intatte. Al fine di analizzare un numero elevato di cellule, la tecnica di super-risoluzione sarà integrata con una piattaforma computazionale ad high throughput per l'analisi multi-parametrica del ciclo cellulare.

Risultati attesi

Ci aspettiamo di osservare alterazioni significative nelle distribuzioni spaziali di replicazione e/o trascrizione, a seguito dell'attivazione dell'oncogene, e che queste alterazioni siano correlate alla generazione di danni in specifici siti fragili del genoma. Ci aspettiamo anche di determinare come le alterazioni nella distribuzione spaziale di elementi specifici della DDR, come PARP, promuovano la replicazione e / o lo stress di trascrizione verso un livello crescente di danno genomico.

Impatto

La conoscenza dei meccanismi molecolari alla base della generazione di danni indotti dall'oncogene rivelerà i meccanismi di base della crescita tumorale e aiuterà a comprendere le origini del cancro. Potremmo anche capire come le alterazioni della DDR possano essere sfruttate contro il cancro. Inoltre, la conoscenza dei meccanismi molecolari di azione dei farmaci che sfruttano la DDR, come gli inibitori del PARP, fornirà una progettazione più efficiente delle strategie terapeutiche per i pazienti oncologici.